服務(wù)介紹

針對各類RNA分子，例如mRNA/lncRNA的保守結(jié)構(gòu)域及circRNA的接頭序列進行靶向設(shè)計siRNA序列，對于每條選定的siRNA靶序列，設(shè)計正義鏈和反義鏈，以loop（9nt or 10nt）相連，構(gòu)建shRNA質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染或通過病毒包裝后轉(zhuǎn)染細胞，并對轉(zhuǎn)染細胞進行陽性鑒定和轉(zhuǎn)代細胞株的培養(yǎng)，最終實現(xiàn)對特定RNA特異性敲低的作用。

技術(shù)優(yōu)勢

1. shRNA載體轉(zhuǎn)染效率高、操作簡單、RNA沉默效果易于檢測；

2. 評估挑選特異靶向序列構(gòu)建載體；

項目明細

1. 載體構(gòu)建；

2. 瞬時轉(zhuǎn)染；

3. 特異性引物設(shè)計合成；

4. RT-qPCR驗證；

5. Sanger測序驗證。

客戶提供

1. 基因ID/物種/全長序列

2. 載體名稱

我們提供

1. shRNA質(zhì)粒；

2. 目的載體：10μg質(zhì)粒+200μL甘油菌；

3. 對照載體：10μg質(zhì)粒+200μL甘油菌；

4. 載體構(gòu)建與驗證實驗報告：

①　載體構(gòu)建步驟；

②　載體測序驗證結(jié)果原始文件；

③　細胞轉(zhuǎn)染實驗步驟；

④　qPCR實驗流程方案及產(chǎn)物測序；

⑤　載體構(gòu)建與驗證實驗報告。

案例1：

參考文獻：

Yang R, Chen H, Xing L, Wang B, Hu M, Ou X, Chen H, Deng Y, Liu D, Jiang R, Chen J. Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10. Mol Cancer. 2022 Mar 29;21(1):88. doi: 10.1186/s12943-022-01567-z. PMID: 35351136; PMCID: PMC8961958.

參考文獻：

Chen DL, Sheng H, Zhang DS, Jin Y, Zhao BT, Chen N, Song K, Xu RH. The circular RNA circDLG1 promotes gastric cancer progression and anti-PD-1 resistance through the regulation of CXCL12 by sponging miR-141-3p. Mol Cancer.2021 Dec 15;20(1):166. doi: 10.1186/s12943-021-01475-8. PMID: 34911533; PMCID:PMC8672580.

1. circRNA 的沉默（干擾）怎么做？

基于RNAi技術(shù)對基因進行沉默，實驗中一般設(shè)計合成靶標基因的siRNA，瞬轉(zhuǎn)細胞后進行RT-PCR檢測。

外顯子來源的circRNA因為和mRNA有同樣的外顯子序列，在序列內(nèi)部設(shè)計siRNA靶標無法保證特異性，因此只能針對junction位點處設(shè)計靶標序列，前后移動范圍有限，siRNA通常很難設(shè)計。EiciRNA或者內(nèi)含子來源的環(huán)形RNA，除了針對junction位點處設(shè)計靶標外，也可以嘗試在內(nèi)含子序列上設(shè)計。

2. 設(shè)計siRNA為什么不能連續(xù)G\C超過3個，連續(xù)A\T超過4個？

因為連續(xù) 3個以上的 G 和 C 可以降低雙鏈 RNA 的內(nèi)在穩(wěn)定性，從而抑制 RNAi 作用；連續(xù) 4個以上的 U 和 A 可能終止由 RNA Polymerase III 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。siRNA 序列中的重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)可能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的存在可以降低 siRNA 的有效濃度和沉默效率。