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IRES活性檢測
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服務介紹
circRNA的翻譯模式分為IRES介導和m6A甲基化修飾介導，針對這些潛在的翻譯方式，吉賽生物提供R系列載體構建和表達驗證服務，驗證circRNA的翻譯是否由IRES介導。
IRES驗證載體示意圖
R1：Empty Vector（Luc2空載體）
Luc2報告載體是基于海腎熒光素酶（Renilla Luciferase, R-Luc）和螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase, F-Luc）的cap-independent translation報告載體，R-Luc由5’ m7G帽子結構介導翻譯起始，F-Luc只在插入有IRES（Internal Ribosome Entry Site）活性的序列或能介導翻譯起始的序列時可以翻譯。Luc2空載體含有多克隆酶切位點，命名為Luc2-IRES- Report。
R2：EMCV IRES（插入EMCV IRES序列的Luc2報告載體陽性對照）
Luc2陽性對照載體含有EMCV IRES序列，命名為Luc2-EMCV-IRES-Report。
R3：IRES（插入預測IRES序列的Luc2報告載體）
使用Luc2-IRES-Report載體進行構建，插入預測的IRES序列全長。
R4：IRES-Del1（插入預測IRES前半部分序列的Luc2報告載體）
使用Luc2-IRES-Report載體進行構建，插入部分預測的IRES序列（已刪除后半部分）。
R5：IRES-Del2 (插入預測IRES后半部分序列的Luc2報告載體)
使用Luc2-IRES-Report載體進行構建，插入部分預測的IRES序列（已刪除前半部分）。
客戶提供
circRNA名稱（ID）、物種&已預測的IRES序列信息及序列刪減要求信息。
我們提供
1. R系列翻譯Luc2-IRES-Report載體質粒（可選：R1-R5）；
2. 目的載體：10μg質粒+200μL甘油菌；
3. 對照載體：10μg質粒+200μL甘油菌；
4. Luc2-IRES-Report載體構建與驗證實驗報告：
① 載體構建步驟；
② 載體測序驗證結果原始文件；
③ 細胞轉染實驗步驟；
④ 熒光素酶活性檢測實驗報告。
案例展示：
參考文獻：
Chen R, Yang T, Jin B, Xu W, Yan Y, Wood N, Lehmann HI, Wang S, Zhu X, Yuan W, Chen H, Liu Z, Li G, Bowen TS, Li J, Xiao J. CircTmeff1 Promotes Muscle Atrophy by Interacting with TDP-43 and Encoding A Novel TMEFF1-339aa Protein. Adv Sci (Weinh). 2023 Jun;10(17):e2206732. doi: 10.1002/advs.202206732. Epub 2023 Apr 23. PMID: 37088818; PMCID: PMC10265041.
過表達載體構建及鑒定
以PCR擴增hsa_circ_00AAAA IRES全長***bp序列，以BamHI，EcoRI雙酶切連接到Luc2-IRES-Report中。
圖1 Luc2-IRES-Report載體圖譜
載體測序引物：Luc-seqF: CAGGAGGACGCTCCAGATGA
測序峰圖正常，無雜峰或疊帶，序列對比吻合，表明IRES目的序列成功插入Luc2-IRES-Report中，載體構建成功。
R系列載體活性檢測原理簡介：
報告載體質粒轉染細胞，檢測 F-Luc和R-Luc活性，以F-Luc/R-Luc的值判斷序列的IRES活性。
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