服務介紹

慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達，可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的基因治療效果，具有廣闊的應用前景。

吉賽生物針對各種RNA提供慢病毒包裝服務，包括circRNA、mRNA和lncRNA。

技術優勢

1. 用于常規細胞感染，強大的基因傳遞工具；

2. 永久整合到基因組中，便于穩轉株的構建，持續傳代；

3. 可用于轉基因動物和動物模型的構建；

4. 基因治療：通過造血干細胞治療遺傳性疾病。例如白血病，地中海貧血等；

5. 細胞治療：CAR-T治療癌癥。

客戶提供

由我司構建載體：載體構建的合同編號和基因名稱（ID）。

由客戶提供載體：載體序列文件，或酶切位點位置以及5’LTR-3’LTR之間的序列長度；濃度>500ng/ul、質粒量>10ug的質粒

我們提供

1. 目的基因慢病毒和對照慢病毒；

2. 慢病毒滴度檢測報告。

慢病毒載體的研究發展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，因此具有廣闊的應用前景。

案例1：

本文研究中，作者通過環狀RNAs測序，在人類ICC組織中鑒定出circNFIB (hsa_circ_0086376，以下簡稱cNFIB)。并進行了一系列的體外和體內實驗，探討cNFIB對MEK抑制劑曲美替尼抗腫瘤活性的影響。

研究結果表明，與曲美替尼和編碼cNFIB的慢病毒載體共治療比單獨的曲美替尼治療表現出更大的抑制作用。[1]

案例2：

Neuro-oncology雜志（IF=10.247）在線發表了中山大學附屬第一醫院張弩教授最新的研究成果，報道發現EGFR來源的circRNA可以特殊的滾環翻譯和程序化-1核糖體移碼（-1PRF）誘導的框外終止密碼子（OSC），形成一系列的滾動翻譯EGFR（rtEGFR）。rtEGFR可以結合并穩定EGFR，在成人膠質母細胞瘤（GBM）成瘤和Nimotuzumab藥敏相關。

在本文研究中，研究者使用慢病毒轉染的穩定細胞系用于評估rtEGF蛋白在體外和體內的生物學功能。研究結果顯示circEGFR在GBM標本中高表達，circEGFR翻譯生成的rtEGFR具有促進BTIC細胞成瘤的能力，干擾circEGFR后抑制成瘤速度。[2]

參考文獻：

[1] Jinpeng Du,Tian Lan,Haotian Liao , et al.CircNFIB inhibits tumor growth and metastasis through suppressing MEK1/ERK signaling in intrahepatic cholangiocarcinoma Mol Cancer.(2022).10.1186/s12943-021-01482-9.

[2] Y. Liu, Z. Li, M. Zhang, H. Zhou, X. Wu, J. Zhong, F. Xiao, N. Huang, X. Yang, R. Zeng, L. Yang, Z. Xia, N. Zhang, Rolling-translated EGFR Variants Sustain EGFR Signaling and Promote Glioblastoma Tumorigenicity,Neuro Oncol(2020). 10.1093/neuonc/noaa279.

慢病毒感染293T 細胞熒光圖

感染48h的細胞圖

qPCR檢測病毒滴度

內參的標準曲線

病毒基因的標曲：

病毒基因的溶解曲線：

病毒滴度結果：

平均每個細胞所含病毒基因數（M1）=病毒基因拷貝數/內參基因拷貝數

病毒滴度（TU/ml）=（細胞數×稀釋倍數×M1）/添加病毒體積（mL）×校正系數×1000

1. 慢病毒包裝的輔助質粒是？

二代輔助質粒：pMD2.G和psPAX2，三代輔助質粒：PLP1、PLP2、PVSV-G

公司目前用的是二代系統。

2. 什么是感染復數（MOI）?

感染復數(MOI) 指感染細胞時一個細胞的病毒感染單元。在實驗中某種細胞感染達到80%時的 MOI定義為這種細胞的最適MOI (實際使用MOI根據實驗要求而定）。

簡而言之，MOI是指感染指數，指病毒對細胞的感染能力；MOI越高，細胞越難被感染。

慢病毒感染MOI計算：

MOI=（病毒滴度×病毒體積）/細胞數目。舉例：滴度1x10^8 TU/ml 的慢病毒感染HEK293細胞所用培養基體積和病毒量；假如24孔板細胞接種量是5x10^4個，6孔板細胞接種為2x10^5個，T25瓶細胞接種量5x10^5個。

在使用慢病毒之前可以通查閱相關文獻，了解慢病毒對目的細胞的親嗜性，感染復數(MOI值）以及在體內注射所需要的病毒量。如果沒有相關文獻支持，可以通過感染預實驗得到合適的感染復數 ( MOI 值）。

3. Puromycin在慢病毒感染的篩選中的作用機制？

Puromycin是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過質粒轉染/轉化、病毒感染等方法能表達pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細胞。Puromycin不僅用于穩定細胞株的篩選，也用于穩定細胞株的維持。

Puromycin的特點是快速作用于細胞，一般2天內可以殺死99%的不表達pac基因的細胞。

4. 質粒包裝完慢病毒再感染細胞，整合到目的細胞染色體上的是整個質粒的線性序列嗎，還是若干個線性的質粒片段？

以pLC5為例，是以過表達3‘LTR至5’LTR段包裝到慢病毒基因組上，而慢病毒基因組是隨機整個整合到宿主基因組上的。出現某些基因如GFP表達比目的基因表達高的情況，是因為各自的啟動子（CMV\EF1a)整合到宿主基因組上后效率不同所致，而且環化RNA的環化也在經過慢病毒包裝、整合宿主基因組以及在宿主環境中目的基因表達及環化裝配等層層過程中衰減很多。因此穩轉株過表達效率要比過表達質粒的過表達效率低很多。

5. 用PLC5-ciR質粒包的慢病毒，做了細胞功能性實驗，也就是病毒感染細胞后流式測GFP，發現空載質粒的GFP信號在有些細胞系中隨時間變化而下降的厲害，是什么原因？

一般情況下，病毒整合到基因組會穩定表達GFP。通過GFP的表達量越來越少可知，這個基因在瞬時表達幾代后傳代丟失了。建議先進行穩株篩選，除了GFP外還需要一個篩選基因如puro，藥殺幾代后都帶綠色熒光的話基本就穩定整合到基因組了。如果不做篩選，傳幾代后，基因信號自然會下降直至消失。