circRNA是由前體RNA通過反向剪接（back-splicing）形成的，無5'-帽和3'-poly (A)尾結構的共價閉環單鏈RNA。circRNA在病理和生理過程中起重要作用，具有作為生物標記物、治療靶點和新藥物的潛力。此外，circRNA因獨特的閉環結構而穩定性更強，作為線性mRNA的有效替代品，是下一代RNA療法開發的理想平臺。因此，circRNA在癌癥等多種疾病中的研究備受關注。

吉賽生物是引領circRNA科學研究與應用轉化的先行者，聚焦circRNA細分領域十余年，依托強大的原研開發能力，建立合成生物學、分子生物學、測序及生信等多個技術平臺，可為廣大科研人員提供全流程的circRNA研究解決方案。

 ① RNA-seq或circRNA-seq（Nanopore circRNA全長測序）分析樣本的轉錄組，篩選特定表型或疾病中表達有明顯差異的circRNA；

 ② 轉錄組數據聯合數據庫進行生信分析，得到有潛在研究價值候選circRNA。

圖1 circRNA-seq得到熱圖和散點圖結果顯示宮頸癌（CC）組織中存在數百個circRNA表達差異。[1]

③ 針對編碼circRNA的研究，利用RNA-seq可聯合翻譯組測序Polysome-seq、Ribo-seq或RNC-seq等技術，通過生信分析，可挖掘潛在可翻譯的RNA，并預測相應的IRES元件和ORF序列。

圖2 Polysome-seq、MeRIP-seq及RIP-seq揭示 circMET是m6A修飾的潛在編碼circRNA。[2]

圖3 Ribo-seq分析人類心臟循環的可翻譯circRNA。[3]

圖4 RNA-seq聯合RNC-seq篩選膠質瘤細胞中差異表達的可翻譯circRNA。[4]

相關技術服務：

轉錄組測序：Nanopore circRNA全長測序、circRNA-seq、RNA-seq、Exosome RNA-seq；

翻譯組測序：Polysome-seq、Ribo-seq、RNC-seq

生物信息學：生物醫學大數據挖掘分析、circRNA定制化分析及繪圖、常規組學及多組學聯合分析、單細胞測序數據生信分析

相關產品：

提取與純化：總RNA提取試劑（Trizol）、液體樣品總RNA提取試劑（Trizol LS）、外泌體提取試劑盒

測序建庫：Taqman探針法支原體檢測試劑盒(UNG防污染版)、RNA-seq文庫構建試劑盒、核糖體RNA去除試劑盒 (人/大鼠/小鼠)(植物)

① 內源豐度：qRT-PCR驗證候選circRNA在目標樣品中的內源豐度。篩選對比樣品中表達量有明顯差異，且內源豐度合適的circRNA進行下一步驗證。

圖5 qRT-PCR結果顯示，circCCDC134在24個腫瘤組織和10個轉移組織和CC細胞中過表達[1]

② 環狀結構：設計circRNA引物進行PCR和Sanger測序，結合RNase R耐受實驗鑒定候選分子的環狀RNA結構。

圖6 鑒定circCORO1C環狀結構。

B：RT-PCR和Sanger測序驗證circCORO1C的反向剪接連接；

E：RNase R處理和RT-PCR分析驗證FD-LSC-1和TU-177細胞中circCORO1C的穩定性。[5]

③ 作用定位：熒光原位雜交（FISH）實驗分析候選circRNA主要富集于細胞核還是細胞質。

    不同定位的circRNA的功能和機制類型可能不同，還會影響后續的基因敲低策略的選擇。

圖7 用Cy3標記的circSPON2探針(紅色)進行FISH檢測，顯示circSPON2在PC-3細胞質中富集。[6]

相關技術服務

表達量分析：引物合成及驗證

結構鑒定：circRNA成環驗證和全長鑒定 、RNase R耐受實驗 

定位分析：熒光原位雜交（FISH）、探針設計

相關產品
提取與純化：總RNA提取試劑（Trizol）、液體樣品總RNA提取試劑（Trizol LS）

表達量分析：qRT-PCR試劑盒

結構鑒定：RNase R

定位分析：原位雜交試劑盒

① 在目標細胞中過表達或敲低候選circRNA。

    過表達的方式：轉染體外制備的circRNA、瞬轉circRNA質粒、利用腺相關病毒（AAV）感染或病毒載體構建circRNA過表達的穩轉細胞株等。

    敲低的方式：轉染siRNA、ASO、瞬轉shRNA載體、利用腺相關病毒（AAV）感染或病毒載體構建circRNA敲低的穩轉細胞株等。

    敲低細胞質富集的circRNA可用siRNA和shRNA，敲低細胞核富集的circRNA可用ASO。

圖8 qRT-PCR分析circSTX6敲低和過表達PANC-1和CFPAC-1細胞中circSTX6和線性STX6的表達。[7]

② 細胞功能實驗：CCK8、流式細胞術、劃痕、Transwell等實驗檢測細胞增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲，體外驗證circRNA的功能。

     候選circRNA可影響細胞功能，則可進一步研究作用機制；對細胞功能無影響，則考慮重新篩選circRNA。

圖9 通過EdU、CCK8、Transwell等細胞實驗驗證circSTX6的功能。[7]

相關技術服務

過表達/敲低：circRNA體外合成-LNP包封、circRNA過表達/敲低載體構建及驗證、慢病毒（LV）/腺相關病毒（AAV）包裝、穩株構建、siRNA/ASO設計、合成及驗證

細胞功能驗證：CCK8、流式細胞術、劃痕、Transwell……

細胞質定位的circRNA可能通過ceRNA（competing endogenous RNAs,內源競爭RNA）、與蛋白互作、編碼蛋白等機制發揮作用；而細胞核定位的circRNA可能通過與DNA或轉錄因子互作調控轉錄。

圖10 circRNA功能的一般機制[8]

（1）ceRNA機制

miRNA可通過結合mRNA導致基因沉默，而部分circRNA可作為miRNA sponge競爭性結合miRNA，從而調控基因表達。

miRNA基因沉默過程中涉及的AGO2是將miRNA加工為成熟的沉默合體（miRISC）的關鍵蛋白。

① 驗證circRNA與miRISC互作

·用anti-AGO2抗體進行RIP-qPCR實驗，檢測AGO2與circRNA的結合；

·通過標簽法體內RNA pulldown實驗，Western Blot檢測pulldown產物中的AGO2，miRNA-seq分析產物中的miRNA。

圖11 采用AGO2和IgG抗體進行RIP檢測SW620細胞中AGO2與circHAS2的互作。[9]

② 驗證circRNA與miRNA互作

·聯合miRNA-seq和circBank等數據庫預測結果，篩選circRNA互作的候選miRNA；

·標簽法circRNA pull-down實驗可同時分析與circRNA結合的miRNA；

·FISH共定位及雙熒光素酶實驗驗證miRNA與circRNA的結合；

·轉染miRNA mimic或inhibitor到細胞中，驗證miRNA的細胞功能。

圖12 雙熒光素酶實驗研究circEYA3與miR-1294互作。[10]

③ 研究miRNA的靶mRNA

·mRNA-seq分析聯合生信分析預測結果，篩選miRNA的靶mRNA；

·轉染miRNA mimic或inhibitor到細胞中，驗證mRNA的表達量變化，研究miRNA與mRNA的表達關系；

·雙熒光素酶實驗驗證miRNA和mRNA的互作。

圖13 A：利用數據庫預測miR-1294的靶基因；

B-C：轉染miR-1294 mimic或inhibitor，qRT-PCR檢測c-Myc和SURF4的表達；

D-F：雙熒光素酶實驗驗證miR-1294與c-Myc互作。[10]

④ 體外機制驗證

·進行挽救實驗，體外驗證circRNA-miRNA-mRNA的相互作用機制。

（2）與蛋白互作影響蛋白功能

circRNA可作為支架，或蛋白sponge，調節蛋白之間的互作或蛋白的功能。

① circRNA pulldown聯合LC-MS/MS和Western Blot定性或定量分析circRNA互作的蛋白。

圖14 探針法circRNA pulldown聯合LC-MS/MS和Western Blot分析circCDK13互作的蛋白。[11]

②利用互作蛋白特異性抗體進行RIP-qPCR反向驗證蛋白與circRNA的互作。

圖15 RIP驗證circCDK13與IGF2BP3之間的相互作用。[12]

③ 免疫熒光結合熒光原位雜交（IF-FISH）可檢測circRNA和目標蛋白細胞或組織中的互作情況。

圖16 IF-FISH檢測顯示circACTN4與FUBP1在乳腺癌細胞核中共定位。[12]

④ Co-IP實驗可研究circRNA是否影響蛋白之間相互作用。

⑤ 通過細胞實驗體外驗證circRNA-蛋白互作機制。

（3）編碼蛋白

circRNA曾被認為是“非編碼RNA”，后來陸續有研究證明circRNA可以編碼多肽或蛋白，并發揮特定的功能。

①編碼能力

·Polysome-seq、Ribo-seq或RNC-seq聯合生信分析可預測有翻譯或編碼可能性的circRNA及其ORF和IRES元件；

·構建T系列載體，可進一步驗證circRNA的翻譯能力。

圖17 構建T系列載體，驗證circCAPG的編碼潛能。[13]

③ 翻譯產物

利用標簽抗體或制備特異性抗體IP/Co-IP下拉翻譯產物，采用靈敏且快速掃描的LC-MS/MS結合Western Blot分技術，定性或定量分析翻譯的產物。

圖18 利用 FLAG抗體進行IP，質譜檢測circCAPG-FLAG中CAPG-171aa，并分析其氨基酸序列。[13]

③ 翻譯機制

典型IRES元件介導：構建R系列載體，可驗證目的circRNA翻譯是否為典型IRES元件介導，并驗證IRES元件的活性。

圖19 構建R系列載體，驗證circCAPG的IRES活性。[14]

m6A甲基化修飾介導：

·MeRIP實驗可分析目的circRNA是否存在m6A甲基化修飾；

·RIP實驗可分析與m6A甲基化修飾相關蛋白與目的circRNA的互作；

·通過干擾或過表達m6A甲基化修飾相關蛋白，研究m6A甲基化修飾與目的circRNA翻譯的關系。

圖20 根據MeRIP-seq結果研究m6A介導circRNA翻譯。[15]

④ 翻譯產物功能

通過構建circRNA過表達、翻譯產物及相關突變體過表達載體，轉染細胞進行細胞實驗驗證circRNA或翻譯產物的功能。

（4）調控轉錄

① circRNA pulldown-LC-MS/MS結合RIP可分析circRNA與轉錄相關蛋白的相互作用；

② Co-IP實驗結合circRNA的功能獲得或喪失實驗，可分析circRNA是否促進轉錄相關蛋白之間的互作；

③ 利用轉錄因子抗體進行ChIP-seq，結合數據庫預測結果可篩選調控轉錄的靶基因；

④ 雙熒光素酶報告檢測實驗結合挽救實驗，可進一步驗證circRNA-轉錄相關蛋白-靶基因DNA之間的相互調控作用。

圖21 CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7轉錄。

A-C：利用ChIP-seq對FRH0201細胞中YBX1結合區域的全基因組分布進行分析；

D：聯合RNA-seq和ChIP-seq結果得到靶基因FZD7和LRP1；

E：ChIP-qPCR檢測FRH0201細胞中FZD7啟動子TSS - 1200 ~ - 800 bp區域YBX1富集增加。[16]

相關技術服務

機制研究：RIP-qPCR/RIP-seq、RNA pulldown-WB/LC-MS/MS、miRNA-seq、熒光素酶報告檢測、mimic/inhibitor、FISH/IF-FISH檢測、Co-IP、MeRIP-seq、ChIP-seq、RNA-seq

相關產品

分子互作：RNA pull-down試劑盒、RIP試劑盒、ChIP試劑盒、Co-IP試劑盒

建立動物模型，利用體外制備的LNP-circRNA或病毒載體遞送動物體內，驗證circRNA在體內的功能，對生理或病理的調控作用。

圖22 動物模型驗證CircSTX6在體內的作用。[7]

相關技術服務

過表達/敲低：circRNA體外合成-LNP包封、circRNA過表達/干擾載體構建及驗證、慢病毒（LV）/腺相關病毒（AAV）包裝、穩株構建

案例文獻：

[1] Liang L et al. ALKBH5-mediated m6A modification of circCCDC134 facilitates cervical cancer metastasis by enhancing HIF1A transcription. J Exp Clin Cancer Res. 2022, 41(1):261.

[2] Zhong J, et al. Circular RNA encoded MET variant promotes glioblastoma tumorigenesis. Nat Commun. 2023, 14(1):4467.

[3] van Heesch S et al. The Translational Landscape of the Human Heart. Cell. 2019, 178(1):242-260.e29.

[4] Zhang M et al. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun. 2018 , 9(1):4475.

[5] Wu Y et al. Circular RNA circCORO1C promotes laryngeal squamous cell carcinoma progression by modulating the let-7c-5p/PBX3 axis. Mol Cancer. 2020, 19(1):99.

[6] Yao B et al. The circSPON2/miR-331-3p axis regulates PRMT5, an epigenetic regulator of CAMK2N1 transcription and prostate cancer progression. Mol Cancer. 2022, 21(1):119.

[7] Meng L et al. CircSTX6 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma progression by sponging miR-449b-5p and interacting with CUL2. Mol Cancer. 2022, 21(1):121.

[8] Kristensen LS et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019, 20(11):675-691.

[9] Li H et al. CircHAS2 activates CCNE2 to promote cell proliferation and sensitizes the response of colorectal cancer to anlotinib. Mol Cancer. 2024, 23(1):59.

[10] Rong Z et al. Circular RNA CircEYA3 induces energy production to promote pancreatic ductal adenocarcinoma progression through the miR-1294/c-Myc axis. Mol Cancer. 2021, 20(1):106.

[11] Huang Q et al. circCDK13-loaded small extracellular vesicles accelerate healing in preclinical diabetic wound models. Nat Commun. 2024, 15(1):3904.

[12] Wang X et al. The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC. Mol Cancer. 2021, 20(1):91.

[13] Song R, et al. A novel polypeptide CAPG-171aa encoded by circCAPG plays a critical role in triple-negative breast cancer. Mol Cancer. 2023, 22(1):104.

[14] Chen R, et al. CircTmeff1 Promotes Muscle Atrophy by Interacting with TDP-43 and Encoding A Novel TMEFF1-339aa Protein. Adv Sci (Weinh). 2023, 10(17):e2206732.

[15] Yang Y, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res. 2017, 27(5):626-641.

[16] Chen Q et al. Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription. J Hepatol. 2022, 76(1):135-147.