根據中心法則，DNA是遺傳信息的載體，蛋白質是生物活動的主要執(zhí)行者。蛋白表達豐度受RNA合成（轉錄）、RNA降解（轉錄后）、蛋白質合成（翻譯）和降解（翻譯后）等多個過程的影響。

RNA翻譯蛋白過程連接轉錄組和蛋白質組，極消耗能量，因而受嚴密的調控，以節(jié)省細胞資源，并避免毒性蛋白質的產生。

翻譯速率可決定蛋白質的折疊構象、定位與功能、產量及對應的細胞表型。蛋白質合成(翻譯)速率與最終蛋白質豐度的相關性較高，翻譯速率對蛋白質水平的貢獻最大。因此，翻譯組研究是分析基因表達和調控水平的重要環(huán)節(jié)。

更重要的是，近年來陸續(xù)有研究發(fā)現，曾被認為非編碼的RNA（ncRNA）可編碼或翻譯蛋白，而翻譯組分析可精準可視化研究編碼全新隱秘多肽的ncRNA（如circRNA、lncRNA）。

01丨多聚核糖體圖譜分析（Polysome profiling）

——傳統的“黃金標準”

Polysome profiling技術是基于蔗糖濃度梯度溶液超離心，將細胞質RNA分離成多個組分：游離RNA，結合核糖體40S或60 S亞基、單核糖體(80S)或多聚核糖體等。一條翻譯的mRNA可同時結合多個核糖體，結合核糖體組分的RNA與總胞質RNA的比例可以間接反映翻譯水平。

丨Polysome profiling步驟

①裂解細胞：添加翻譯延伸抑制劑，在增殖階段裂解細胞，分離細胞質裂解液；

②超速離心：把裂解液轉移到梯度蔗糖溶液后，超速離心將RNA分離成不同的組分；

③收集組分：利用密度梯度分餾系統，UV吸光度檢測核酸濃度并收集各個組分；

④回收產物：從蔗糖溶液組分中回收RNA復合物；

⑤分析產物：繪制核糖體圖譜；RT-qPCR分析特定RNA；高通量測序分析全局RNA概況；Western Blot或質譜分析蛋白質。

圖1 Polysome Profiling技術路線圖。（source：Su D, et al., 2024）

丨Polysome profiling技術優(yōu)勢

① 直觀反映細胞和組織內的翻譯狀態(tài)；

② 對胞質RNA翻譯水平分級，可針對感興趣組分進一步分析不同的翻譯機制；

③ 結合高通量測序可全面、精準、高通量反映翻譯組概況。

Polysome profiling技術局限

① 需專門設備在常規(guī)實驗室可能無法獲得；

② 操作較繁瑣：需一系列繁瑣的溶液配置、離心、分離、檢測等操作步驟，耗時長且對操作者要求較高；

③ 容易受干擾：細胞內普遍存在高分子量的復合物，容易對多聚核糖體收集和檢測造成干擾。

02丨核糖體印跡測序（Ribo-seq）

——更詳細地分析翻譯的強大工具

Ribo-seq可獲得核糖體沿著翻譯mRNA的精確位置，從而得到詳細翻譯事件的直接證據，可在密碼子分辨率上進行全翻譯組檢測。

丨Ribo-seq步驟

① 使用延長抑制劑阻止核糖體移位，然后收取細胞;

② 用RNase消化細胞裂解物，裸露的RNA片段打斷，而核糖體保護RNA片段得以保留；

③ 去除干擾的rRNA，去除核糖體，收集核糖體保護片段(RPF)，也稱為核糖體足跡;

④ 建庫，針對RPF深度測序并分析獲取的核糖體足跡數據。

丨Ribo-seq技術優(yōu)勢

① 提供精確而豐富的核糖體位置信息，可更詳細分析翻譯調控事件，包括翻譯起始、延伸、停止和終止或非常規(guī)的翻譯事件，如非AUG介導的翻譯起始、停止密碼子讀取、以及翻譯新的小開放閱讀框(sORF)，或以前被認為是非編碼RNA (ncRNAs)的非典型可翻譯RNA；

② 可瞬時捕獲翻譯過程的狀態(tài)，定量分析翻譯效率，對研究翻譯調控動態(tài)變化具有重要意義；

③ Ribo-seq可同時捕獲大量基因的翻譯活動，為構建全局性翻譯提供可能，結合RNA-seq，可系統研究基因表達與翻譯調控之間的關系。

丨Ribo-seq技術局限

① 細胞中不同的mRNA的核糖體延伸率不同，無法區(qū)分翻譯活躍的核糖體和停滯狀態(tài)的核糖體，可能導致翻譯效率的偏差；

② 小RNA片段(如調控性非編碼RNA)的污染可能導致翻譯組數據的誤解；

③ 核糖體的構象、不適當的核酸酶酶切和特定的RNA二級結構，都可能影響足跡長度。

03丨核糖體-新生體-鏈復合體測序（RNC-seq）

——全長翻譯mRNA測序

RNC-seq技術分離出核糖體結合RNA進行高通量測序，不經過RNase處理，保留RNA全長信息。

丨RNC-seq技術優(yōu)勢

① 實驗操作較簡便；

② 較長的片段建庫，排除了潛在的污染物(如調控性小RNA)；

③ 長片段更可能跨越mRNA和circRNA的剪接位點，檢測更多的選擇性剪接(AS)異構體或翻譯circRNA；

④ 與RNA-seq結合使用，可通過計算翻譯比率，評估哪些mRNA剪接變體在全基因組范圍內翻譯。

丨RNC-seq技術局限

①RNC RNA易降解；

②一個或多個核糖體結合的翻譯RNA分子被統一分析，而不是像polysome Profiling分成多個組分進行分析，翻譯效率分析準確性較低；

③若無合適計算分析，RNC-seq由于丟失了翻譯RNA上核糖體的位置信息，而無法精確定義非常規(guī)ORF的位置，只能為非規(guī)范ORF的翻譯提供間接證據。

04丨雙核糖體測序（Disome-seq）

——翻譯調控研究新技術

停滯的核糖體(stalled ribosomes)是指在翻譯過程中暫時停止或顯著放慢移動的核糖體。核糖體停滯可能由于多種原因，包括罕見密碼子的存在、mRNA的超二級結構、損壞的mRNA或特定的結合蛋白質的存在，直接導致異常蛋白的合成或核糖體的缺乏，從而調控翻譯。核糖體碰撞形成的串聯雙核糖體，可介導共翻譯事件，對細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。

Disome-seq是基于Ribo-seq發(fā)展的技術，通過分離核糖體-RNA復合物，用RNase進行酶切消化，裸露的RNA被酶切，而核糖體保護的RNA得以保留。然后分離純化得到雙核糖體保護的RNA片段，進行建庫測序。

Disome-seq具有Ribo-seq技術的優(yōu)勢的同時，可針對雙核糖體碰撞發(fā)生的RNA進行分析，有利于研究共翻譯等特殊翻譯調控機制。

丨Disome-seq技術優(yōu)勢

①揭示全局RNA中碰撞雙核糖體的足跡；

②針對性研究翻譯停滯、共翻譯等特殊的翻譯調控事件。

丨Disome-seq技術局限

① 僅針對性分析串聯雙核糖體結合的RNA；

② 對樣品處理和分析的要求較高，可通過增加核糖體圖譜分析環(huán)節(jié)，通過檢測雙核糖體的特征峰，篩選合格樣本進入下游分析流程，有效保障建庫測序數據質量。

Polysome profiling可以準確研究翻譯效率，研究翻譯調控、翻譯活性等；

Ribo-seq可以研究RNA的翻譯機制、翻譯起始和終止位點及ORF等；

RNC-seq可以研究翻譯復合物的組成和活性，以及挖掘潛在可翻譯的非典型RNA；

Disome-seq可以分析雙核糖體或核糖體碰撞事件研究特定的翻譯調控機制。

其中，Ribo-seq和RNC-seq實際上是從兩個不同的方面評估RNA翻譯，兩者不能相互替代。

吉賽翻譯組技術服務內容

吉賽生物可提供Ploysome profiling、Ribo-seq和RNC-seq一系列經典翻譯組研究技術服務，還可提供Polysome-seq和Disome-seq，可根據個性化需求選取不同、單/多個分離組分進行建庫測序。翻譯組研究無煩惱！

                                                                   Polysome Profiling圖譜示例

特點	Polysome profiling/ Polysome-seq	Ribo-seq	RNC-seq	Disome-seq
mRNA長度	全長	核糖體保護片段區(qū)域	全長	雙核糖體保護片段區(qū)域
翻譯中RNA回收難度	難	難	易	難
起始量	多	多	少	多
測序方法	Microarray/NGS	NGS	Microarray/NGS	NGS
測序長度	任意	22-35 nt	任意	約54-68 nt
檢測序列變異	√	×	√	×
UTR	√	×	√	×
檢測核糖體位置、密度、ORF、uORF	×	√	×	√
每條mRNA上核糖體數目	√	×	×	×
技術難點	離心，梯度液分離，RNA 回收	酶切條件	RNC-mRNA 易斷裂	酶切條件
生理條件	√	√	√	√
吉賽服務項目	圖譜（5或18組分）	Ribo-seq測序分析	RNC-seq測序分析	無圖譜-Disome-seq測序分析
	圖譜+RNA（5或18組分）
	圖譜+qPCR（5或18組分）
	圖譜+WB（5或18組分）			圖譜+Disome-seq測序分析
	圖譜+測序（組分⑤單文庫）
	圖譜+測序（雙文庫-Light+Heavy組分）
	圖譜+測序（雙文庫-Free+Binding組分）