RNase R是一種來源于大腸桿菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可從3’-5’方向?qū)NA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化幾乎所有的線性RNA分子，但不易消化環(huán)形RNA、套索結(jié)構(gòu)或3’突出末端少于7個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子。

RNase R是circRNA的鑒定和富集實(shí)驗(yàn)必備工具酶，可消化線性RNA以使環(huán)形RNA（circRNAs）或套索結(jié)構(gòu)RNA（lariat RNA）得到富集。

應(yīng)用場(chǎng)景

1. circRNA的鑒定

根據(jù)RNase R(+)和RNase R(-)組中是否檢測(cè)到條帶來證明檢測(cè)的分子是否是circRNA。

圖2.RNase R消化后RT-PCR檢測(cè)Lariat/Circular RNA

在圖2中，檢測(cè)mRNA在RNase R(-)中有條帶，在RNase R(+)中無條帶；檢測(cè)Lariat/Circular RNA，在RNase R(-)和RNase R(+)樣品中都有條帶，表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）。

2. circRNA的富集

高通量測(cè)序時(shí)常需要對(duì)circRNA進(jìn)行富集，為探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相關(guān)基因的變化，可以同時(shí)做RNase R(+)和RNase R(-)組樣品的測(cè)序。

圖3.RNase R(+)和RNase R(-) RNA測(cè)序示意圖（Jeck WR et al., 2014）

有研究報(bào)道，測(cè)序顯示RNase R(+)組中Junction Reads相對(duì)于RNase R(-)樣本有5-10倍的富集，可鑒定出幾千到上萬個(gè)circRNAs（圖3）。

3.circRNA的純化

消除線性RNA殘余的干擾，是人工合成高純度circRNA的關(guān)鍵。高效的RNase R不僅是連接酶法circRNA人工合成的關(guān)鍵工具，在內(nèi)含子自剪切的circRNA人工合成中也是必不可少的。

圖4. 吉賽生物circPrecise?平臺(tái)制備環(huán)狀RNA產(chǎn)物（“純化產(chǎn)物”使用GSPure? RNase R純化）

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

特異性強(qiáng)：特異性消化線性RNA；

高效快速：5-15min即可消化大部分線性RNA；

Buffer兼容：消化產(chǎn)物可直接用于下游實(shí)驗(yàn)；

使用方便：體系簡(jiǎn)單，37℃一步反應(yīng)。

質(zhì)量控制

SDS-PAGE 檢測(cè)純度>95%；Total RNA經(jīng)RNase R消化后進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，線性 RNA豐度明顯降低，環(huán)形RNA豐度基本不變。

性能比較

1.RNA電泳檢測(cè)

將10U RNase R加入到2.5 μg Total RNA中，于37℃孵育15 min后直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示RNase R(+)組條帶變淡（不可見），表明RNase R對(duì)Total RNA產(chǎn)生消化作用。吉賽和公司A或公司E的RNase R對(duì)Total RNA消化效果相當(dāng)。

3.RT-qPCR檢測(cè)

將10U RNase R加入到2.5 μg total RNA中，于37℃孵育30 min后進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示RNase R+組β-actin和FGFR2的豐度都明顯降低，表明RNase R可消化線性RNA。吉賽和公司E的RNase R對(duì)線性RNA消化效果相當(dāng)，優(yōu)于公司A的RNase R。

案例1：

2022年7月21日，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院關(guān)鋒教授團(tuán)隊(duì)在C1GALT1在膀胱癌中的生物功能及其調(diào)控機(jī)制的研究中取得了新進(jìn)展，研究結(jié)果發(fā)表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，題名“Dysregulation and prometastatic function of glycosyltransferase C1GALT1 modulated by cHP1BP3/ miR-1-3p axis in bladder cancer”。

研究團(tuán)結(jié)隊(duì)使用RNase R（R0301，吉賽生物）檢測(cè)了7個(gè)DEcircRs對(duì)RNase R消化的敏感性，以排除可能通過反式剪接、基因組重排或PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的頭尾剪接。證明DEcircRs對(duì)RNase R的抗性均高于GAPDH對(duì)照。

案例2：

2022年8月12日，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院張衛(wèi)光教授團(tuán)隊(duì)在Redox Biology雜志在線發(fā)表了題為“CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)circRNA分子 circSV2b在帕金森病（Parkinson's disease，PD）發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，并揭示了其作用機(jī)制。

研究團(tuán)結(jié)隊(duì)使用RNase R（R0301，吉賽生物）處理顯著降低線性SV2b和β-Actin的mRNA水平，而circSV2b的量未觀察到明顯的改變，證明circSV2b是一個(gè)高度穩(wěn)定且內(nèi)含子保留的環(huán)狀RNA。

[1] IF27.401 A novel protein AXIN1-295aa encoded by circAXIN1 activates the Wnt/β-catenin signaling pathway to promote gastric cancer progression. Molecular Cancer

[2] IF15.302 circPARD3 drives malignant progression and chemoresistance of laryngeal squamous cell carcinoma by inhibiting autophagy through the PRKCI-Akt-mTOR pathway. Molecular Cancer

[3] IF15.302 Circular RNA circCORO1C promotes laryngeal squamous cell carcinoma progression by modulating the let-7c-5p/PBX3 axis. Molecular Cancer

[4] IF13.493 The circFASN/miR-33a pathway participates in tacrolimus-induced dysregulation of hepatic triglyceride homeostasis. Signal Transduction and Targeted Therapy

[5] IF12.658 Dysregulation and prometastatic function of glycosyltransferase C1GALT1 modulated by cHP1BP3/ miR-1-3p axis in bladder cancer. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[6] IF11.556 Engineering circular RNA regulators to specifically promote circular RNA production. Theranostics

[7] IF11.492 CircIMMP2L promotes esophageal squamous cell carcinoma malignant progression via CtBP1 nuclear retention dependent epigenetic modification. Clinical and Translational Medicine

[8] IF11.161 Circular RNA circ-MTHFD1L induces HR repair to promote gemcitabine resistance via the miR-615-3p/RPN6 axis in pancreatic ductal adenocarcinoma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[9] IF11.161 Warburg effect-promoted exosomal circ_0072083 releasing up-regulates NANGO expression through multiple pathways and enhances temozolomide resistance in glioma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[10] IF11.161 CircFAM73A promotes the cancer stem cell-like properties of gastric cancer through the miR-490-3p/HMGA2 positive feedback loop and HNRNPK-mediated β-catenin stabilization. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[11] IF11.161 CircAGAP1 promotes tumor progression by sponging miR-15-5p in clear cell renal cell carcinoma. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[12] IF10.392 A novel intronic circular RNA, circGNG7, inhibits head and neck squamous cell carcinoma progression by blocking the phosphorylation of heat shock protein 27 at Ser78 and Ser82. Cancer Communications

[13] IF10.122 Lipotoxicity-induced circGlis3 impairs beta cell function and is transmitted by exosomes to promote islet endothelial cell dysfunction. DIABETOLOGIA

[14] IF8.886 circRNA-0002109 promotes glioma malignant progression via modulating the miR-129-5P/EMP2 axis. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[15] IF8.886 HnRNP-L-regulated circCSPP1/miR-520h/EGR1 axis modulates autophagy and promotes progression in prostate cancer. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[16] IF8.886 Effects of long-term culture on the biological characteristics and RNA profiles of human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[17] IF8.886 CircSTK40 contributes to recurrent implantation failure via modulating the HSP90/AKT/FOXO1 axis. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[18] IF8.579 circPTCH1 promotes invasion and metastasis in renal cell carcinoma via regulating miR-485-5p/MMP14 axis. Theranostics

[19] IF8.469 Circular RNA hsa_circ_0043280 inhibits cervical cancer tumor growth and metastasis via miR-203a-3p/PAQR3 axis. Cell Death & Disease

[20] IF8.469 CircHAS2 promotes the proliferation, migration, and invasion of gastric cancer cells by regulating PPM1E mediated by hsa-miR-944. Cell Death & Disease

[21] IF8.469 Autophagy-related circRNA evaluation reveals hsa_circ_0001747 as a potential favorable prognostic factor for biochemical recurrence in patients with prostate cancer. Cell Death & Disease

[22] IF8.469 Circular RNA circACSL1 aggravated myocardial inflammation and myocardial injury by sponging miR-8055 and regulating MAPK14 expression. Cell Death & Disease

[23] IF8.469 Circular RNA circRUNX1 promotes papillary thyroid cancer progression and metastasis by sponging MiR-296-3p and regulating DDHD2 expression. Cell Death & Disease

1.RNase R消化成功的標(biāo)準(zhǔn)？

建議RNA經(jīng)RNase R消化后取一部分直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，28、18S條帶變淡說明消化成功。（電泳結(jié)果比較直接，可觀測(cè)到消化成功，若不成功就是有問題）

2.RNase R實(shí)驗(yàn)怎樣設(shè)計(jì)對(duì)照組？

參考下圖多幾個(gè)分組和對(duì)照，排除下影響因素。（增加多個(gè)對(duì)照，可以排除和找出異常情況的原因）

3.RNase R實(shí)驗(yàn)的條件？

消化時(shí)間和RNase R用量可能需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，找到合適的條件，讓線性RNA被消化而 circRNA保持不變。一般37℃消化15min，檢測(cè)內(nèi)參的Ct值延后5~10都是比較成功的結(jié)果。（考慮消化不夠或過頭，或者結(jié)果數(shù)值不好看，可以做預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索）

4.RNase R引物檢測(cè)的問題？

注意檢測(cè)引物的特異性問題。注意區(qū)分circRNA和mRNA的同源序列。（引物有非特異擴(kuò)增的時(shí)候，檢測(cè)結(jié)果數(shù)值完全不可能，任何說消化無效果或效果過頭都不可信）

5.CircRNA數(shù)量不變，算成功嗎？

總RNA被消化后，線性RNA數(shù)量減少，circRNA數(shù)量基本不變，則其中circRNA的比例增加了，即circRNA被富集了，后面qPCR檢測(cè)circRNA的豐度有可能會(huì)偏高，是正常的。

6. RNase R消化后如何回收RNA？

RNase R消化后消化液如果回收，圖方便可以使用Trizol回收，按說明書操作即可。如果不回收直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的，吸取消化液的體積不能超過逆轉(zhuǎn)錄體系的1/4，因?yàn)橄褐袣埩舻碾x子等會(huì)干擾下游的RT-qPCR反應(yīng)。例如逆轉(zhuǎn)錄是20ul體系，則吸取的RNase R消化液不能超過5ul。

7.RNase R消化不成功怎么辦？

使用新的試劑盒或試劑重新提取RNA，保證RNA的純度和質(zhì)量。（RNA的純度高才能消化效率高，酚類等殘留會(huì)明顯影響消化效果，gDNA污染也會(huì)減弱消化效果）

8. RNase R如何儲(chǔ)存

當(dāng)天內(nèi)使用的，RNase R（20U/ul）可以用無酶水稀釋，長期使用的，應(yīng)該用Storage Buffer稀釋，配方在說明書里有。(用量少時(shí)體積小，有客戶想稀釋使用)

9.RNase R消化有什么注意事項(xiàng)

配置Nuclease-free的試劑，需要使用Nuclease-free的水、吸頭等試劑耗材，或者用DEPC處理過的水，另外實(shí)驗(yàn)臺(tái)面（建議全程超凈臺(tái)內(nèi)或生物安全柜內(nèi)）也要用核酸酶清除劑噴霧和擦拭處理，這些都是做RNA實(shí)驗(yàn)的配置。

10.RNase R消化的特殊情況

特殊情況：有的線性RNA耐受消化，有的circRNA也容易被消化。

11.RNase R消化后不用純化，直接跑膠，是否可以？

可以的。還能評(píng)估下消化效果，28、18S條帶變淡說明消化成功。

另，直接進(jìn)行RT-PCR的，一般也可以不做純化，酶失活后直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)即可。

12.消化反應(yīng)中RNase R使用多少比較合適？

不同參考文章里RNase R的使用量和反應(yīng)體系都有差別，最常見的是20 μL反應(yīng)體系，使用比例為1-4 U RNase R/μg RNA，實(shí)驗(yàn)中可能需要摸索調(diào)整。

13.RNase R消化反應(yīng)溫度和時(shí)間設(shè)定多少？

RNase R消化一般于37℃進(jìn)行反應(yīng)，一般10-30 min即可消化掉大部分線性 RNA。常用5-15 min消化就能得到很好的結(jié)果。

14.RNase R消化反應(yīng)后要不要滅活？

經(jīng)RNase R消化后直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的，推薦在37℃反應(yīng)結(jié)束后保持70℃ 10 min使RNase R滅活（也有65℃ 15min）。如果消化后要進(jìn)行純化回收，也可以不做滅活。

15.RNase R消化鑒定

樣本RNase R消化前后取一部分直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，可直觀查看抽提的RNA質(zhì)量及Rnase R消化效果，28、18S條帶變淡說明消化成功。若RNA純度不高，28S/18S條帶可能有凹型拖尾。若RNA有g(shù)DNA污染，可能殘留gDNA條帶。

16.RNase R消化反應(yīng)條件？

不同的circRNA對(duì)RNase R的耐受性不同，具體反應(yīng)時(shí)間需要自行摸索。一般反應(yīng)時(shí)間為10-30 min，不推薦過長時(shí)間的消化。個(gè)別circRNA耐受RNase R消化力弱。對(duì)此，可以減少消化時(shí)間。

17.RNase R消化后需要測(cè)定產(chǎn)物濃度嗎？

不可直接測(cè)定RNA濃度，因?yàn)榉磻?yīng)體系內(nèi)的蛋白質(zhì)、鹽離子等成分會(huì)導(dǎo)致RNA濃度測(cè)定不準(zhǔn)確。建議先純化RNA再測(cè)定濃度。

18.RNase R消化后產(chǎn)物處理：

直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的，推薦RNase R滅活。滅活條件為：70℃保持15min。吸取消化液的體積不能超過逆轉(zhuǎn)錄體系的1/4，因?yàn)橄褐袣埩舻碾x子等會(huì)干擾下游的RT-qPCR反應(yīng)。例如逆轉(zhuǎn)錄是20ul體系，則吸取的RNase R消化液不能超過5ul。

如果消化后要進(jìn)行純化回收，也可以不做酶的失活。